通过使用来自猴子（日本猕猴）肝脏的体外制剂进行与活性氧物质相关的应激酶的测定。Ge-132，一种有机锗化合物，即 poly-trans-[(2-carboxyethyl) germasesquioxane] [(GeCH 2 CH 2 COOH) 2 O 3 ] n , 抑制NADH 依赖性氧化酶和 NADPH 依赖性氧化酶 [NAD(P)H-OD] 和黄嘌呤的活性氧化酶 (XOD) 作为超氧化物形成酶，同时促进作为超氧化物清除酶的超氧化物歧化酶 (SOD) 和作为负责降解过氧化氢 (H 2 O 2 ) 的酶的过氧化氢酶 (CAT )的活性). 证据表明， Ge-132 会降低 Ge-132和 H 2 O 2等活性氧物质的水平。在这些结果的基础上讨论了 Ge-132 与应激酶活性之间可能存在的联系。
关键词
活性氧，应激酶 [CAT，NAD(P)H-OD，SOD，XOD]， Ge-132 [(GeCH 2 CH 2 COOH) 2 O 3 ] n，猴肝
有氧呼吸和底物氧化会产生活性氧。在受到各种压力的生物体细胞中，1 O 2 、 ·OH和H 2 O 2等活性氧的产生增加 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] 。这些活性氧直接作用于酶并破坏细胞。SOD 在细胞中清除并抑制1 O 2和·OH 自由基的形成[ 4 ] [ 5 ]。
有机锗化合物 (Ge-132) 之一的聚反式 [(2-羧乙基) 锗倍半硅氧烷] 在免疫系统疾病患者中显示出血浆超氧化物清除活性 [ 6 ]。
1967年，Oikawa和Kakimoto [ 7 ] (cf. Asai [ 8 ] )首次合成了聚反式-[(2-羧乙基)锗倍半硅氧烷]作为水溶性有机锗化合物，其分子式为[ ( GeCH 2 CH 2 COOH) 2 O 3 ] n , 即 缩写的 Ge-132 通过 X 射线晶体学测定 [ 9 ] 。Ge-132是一种水溶性化合物，其安全性已得到证实 [ 10 ] 。Ge-132 及其水解单体 3-（三羟基甲锗烷基）丙酸 (THGP) 的结构如图 1所示[ 11]] 。Ge-132具有由Ge和O等十二种元素组成的特殊环状结构，在水溶液中可水解成THGPs。当 Ge-132 经口服后从肠道吸收时，Ge-132 经十二指肠水解为 THGP，在体内应作为单体 THGP。但是，在本研究中，我们将其描述为 Ge-132，没有区别。Ge-132 的生理功能实验已在多种生物体（微生物、植物和动物）中进行，镇痛 [ 12 ] 、抗肿瘤 [ 13 ] 、抗病毒 [ 14 ] 、器官保护 [ 15 ] 抗风湿 [ 6 ] 、抗白内障 [ 16 ] , 免疫刺激剂 [ 17 ] 抗氧化 [ 18] 效果以及促进自交不亲和花粉管的生长 [ 19 ] 和“抑制”骨质疏松症 [ 20 ] 的作用已被记录在案。此外，Ge-132 处理可降低低密度脂蛋白 (LDL) 的氧化速率 [ 21 ]，同时促进啮齿类动物胆汁的分泌和抗氧化活性 [ 18 ]。Ge-132 对生理不良状况的这些积极影响可能会鼓励重病患者和体弱多病的动物饲养员。条件
图 1。聚反式-[(2-羧基)锗倍半氧烷] (Ge-132) 及其水解产物 3-(三羟基锗基) 丙酸 (THGPA) 的结构。（根据 Yamaguchi 等人，2015 1 1）。
似乎主要是由活性氧引起的。因此，我们在本研究中的目的是研究 Ge-132 与应激酶活性之间的关系，即 Ge-132 诱导降低活性氧水平。本次研究取得的成果有望给广大患者带来福音。
长叶百合 cv. Hinomoto 有一个配子体自交不亲和系统。因此，在日之本百合中，自交不亲和授粉后的雌蕊可以被认为是受胁迫的。在我们之前的研究中[ 19 ]，与那些在交叉兼容授粉后的雌蕊中。此外，通过锗化合物[Ge-132；自交不亲和授粉后雌蕊花粉管的生长得到促进。[(GeCH 2 CH 2 COOH) 2 O 3 ] n和GeO 2]，显然与抑制形成超氧化物的 NAD(P)H-OD、XOD、SOD 的活性水平以及雌蕊中 CAT 和 APOD 的活性升高有关。换句话说，Ge-132 似乎通过抑制活性氧来刺激雌蕊中花粉管的生长。由于可以想象 Ge-132 也可能以与百合雌蕊相同的方式调节动物组织/细胞中与活性氧物质相关的应激酶的活性。
我们进行了本研究，以检查其对超氧化物形成酶和超氧化物清除酶（如 NAD(P)H-OD、XOD 和 SOD）活性的影响，使用日本猕猴肝脏的制剂作为替代品来自百合花蕊。
2。材料和方法
2.1. 化学品
有机锗 [Ge-132; (GeCH 2 CH 2 COOH) 2 O 3 ]n（图 1）（浅井锗研究所有限公司，函馆，北海道，日本）在本研究中进行了测试。
2.2. 动物材料
本研究使用了一只六岁的日本猕猴 (Macaca fuscata) 的肝脏样本。
伦理
本实验中使用的肝脏样本是组织储备的一部分，这些组织储备是根据日本京都大学灵长类动物研究所批准的动物实验机会收集的，用于多次使用。它是由该研究所通过该研究所运营的联合研究系统提供的。本研究不包括动物实验。
2.3. 肝脏酶组分的制备
所有后续步骤均在 0˚C - 4˚C 下进行，如下所示。部分肝脏 (2 g) 在玻璃匀浆器中在 10 mL 研磨介质中均化，该研磨介质由 0.1 M 吗啉代丙烷磺酸 (MOPS)-KOH (pH 7.5)、1 mM 乙二胺-四乙酸二钠 (Na 2-EDTA), 1 mM 二硫苏糖醇 (DTT)。将匀浆以 15,000 g 离心 7 分钟，并将上清液在 0°C 下超声处理 5 次，每次 10 秒，超声仪（型号 5202；Ohtake Works Co. Ltd.，Tokyo）输出功率为 100 W将超声处理的上清液以 15,000 g 离心 7 分钟。所得上清液的等分试样用于测定 NAD(P)H-OD、XOD 和 CAT 的活性。去除用于测定上述酶活性的等分试样后，剩余的上清液针对含有 1 mM Na 2 -EDTA 和 1 mM DTT 的 10 mM MOPS-KOH (pH 7.5) 在 4˚ 下透析4小时C 用于测定 SOD 的活性。
2.4. 酶活性测定
使用光谱仪（型号 U-3210；日立，东京）在 25˚C 下估计酶的活性。为了制备 Ge-132 的原始（储备）溶液，将粉状 Ge-132 溶解在少量蒸馏水中，并用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 7.0。之后，Ge-132原液用蒸馏水调至100 μM。
NAD(P)H-OD 是通过 Azzi 等人方法的修改版本进行测定的。[ 22 ] 在含有 20 mM N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸 (TES)-KOH (pH 7.0)、40 μM 乙酰化细胞色素 c、40 μM NADPH 或 NADH 的反应混合物 (1 mL) 中, 10 或 0 μg/mL SOD 和 30 μL 酶组分（0.8 mg 蛋白质），以及 0、0.001、0.01、0.1 或 1 μM Ge-132。反应在 25˚C 下进行，随后吸光度 (A) 在 550 nm (A 550 ) 处增加。
XOD 是通过修改后的 Hashimoto 方法 [ 23 ] 测定的。该测定在含有 100 mM 磷酸钾 (K-PO 4 ) (pH 7.5)、0.13 mM 黄嘌呤、0.2 mM K-氧酸盐和 100 μL 酶组分（1.8 mg 蛋白质）的反应混合物 (1.5 mL) 中进行，和 0、0.001、0.01、0.1 或 1 μM Ge-132。反应在 30˚C 下进行 25 分钟，然后通过添加 (50 μL) 100% 三氯乙酸 (TCA) 来终止反应。以 15,000 g 离心 5 分钟后，通过测量 A 292来估计所得上清液中的酶活性。
SOD 是用 Asada 等人的方法的修改版本测定的。[ 24 ]，在含有 50 mM K-PO 4 (pH 7.8)、0.1 mM Na 2 -EDTA、0.1 mM 黄嘌呤、20 μM 细胞色素 c、0.012 U XOD 和酶级分（0 或0.4 mg 蛋白质）和 0、0.001、0.01、0.1 或 1 μM Ge-132。随着 A 550的增加，反应在 25˚C 下进行。特别地，SOD 的活性由 Asada 等人定义的单位显示。[ 24 ]。
在含有 90 mM K-PO 4 ( pH 7.9)、0.043% H 2 O 2和酶组分 (0.6 mg 蛋白质）和 0、0.001、0.01、0.1 或 1 μM Ge-132。随着 A 240的增加，反应在 25˚C 下进行。
上述酶的比活性表示为 μmol/mg 蛋白质/min [NAD(P)H-OD、XOD 和 CAT] 或单位/mg 蛋白质 (SOD)。通过 Lowery 等人的方法对蛋白质进行定量。[ 26 ] ,以牛血清白蛋白为标准。所有实验重复三次，结果相似，并显示了代表性的发现。
3. 结果
3.1. Ge-132对NAD(P)H-OD活性的影响
NAD(P)H-OD 作为超氧化物形成酶的活性受到 Ge-132 的强烈抑制（图 2 (a)），呈负指数曲线。这是
(一)(二)
图 2。Ge-132 对抑制猴肝制剂中超氧化物形成酶活性的影响。(a) NADPH-和NADH-氧化酶；(b) 黄嘌呤氧化酶。数据表示平均值±sem（n = 3 次测量）。RSD 值根据[标准差÷算术平均值] 的等式计算，NADPH 氧化酶、NADH 氧化酶和黄嘌呤氧化酶(XOD) 的值分别为4.3%、5.1% 和4.3%。
与 NADPH-OD 相比，在 NADH-OD 的情况下更明显。在没有 Ge-132 (0 μM) 的测定条件下，NADPH-OD 显示出比 NADH-OD 更高（3.6 倍）的活性。与 NADH-OD 相比，Ge-132 在 1 μM 时，NADPH-OD 显示出高（5.3 倍）活性。换言之，0.001、0.01、0.1 或 1 μM Ge-132 的 NADPH-OD 活性分别被抑制高达 63.8%、47.8%、35.9% 或 31.9%，而 NADH-OD 的活性为 0.001、0.01 , 0.1 或 1 μM Ge-132 与没有 Ge-132 (0 μM) 的相应活性 (100%) 相比分别被抑制高达 57.1%、42.9%、28.6% 或 21.4%。
3.2. Ge-132对XOD活性的影响
XOD 的活性也被 Ge-132 抑制（图 2（b）），呈负抛物线曲线。即，与没有 Ge-132 (0 μM) 的 (100%) 相比，0.001、0.01、0.1 或 1 μM Ge-132 的活性分别被抑制高达 90.8%、89.1%、80.8% 或 45.3% .
3.3. Ge-132对SOD活性的影响
相比之下，Ge-132 促进了 SOD 作为超氧化物清除酶的活性（图 3（a）），具有明显的渐近曲线。与没有 Ge-132 (0 μM) 的 (100%) 相比，0.001、0.01、0.1 或 1 μM Ge-132 的活性分别提高了 174.2%、171.4%、176.9% 或 177.5%。
3.4. Ge-132对CAT活性的影响
Ge-132 也促进了 CAT 作为负责过氧化氢降解的酶的活性（图 3 (b)），具有渐近曲线。与没有 Ge-132 (0 μM) 的 (100%) 相比，0.001、0.01、0.1 或 1 μM Ge-132 的活性分别提高了 162.9%、182.2%、188.7% 或 193.5%。
4。讨论
在我们之前的研究中，自交不亲和授粉后的日之本百合雌蕊花粉管的生长通过 Ge-132 处理得到促进 [ 19 ] 。由于日之本百合具有自交不亲和系统，自交不亲和授粉后雌蕊中的应激酶活性较异交亲和授粉后高，Ge-132促进自交不亲和授粉后花粉管的生长可能是由于其调节应激酶，如 NAD(P)H-OD、XOD、SOD、CAT 和 APOD。简而言之，活性氧物质（例如H 2 O 2 ）水平的降低可能直接参与了 Ge-132 对花粉管生长的促进作用。
在使用猴肝细胞的初步实验中，NAD(P) H-OD 的活性实际上被 Ge-132 抑制（数据未显示），显然是由于涉及底物 [NAD(P)H] 的非竞争性抑制。
在本研究中，日本猕猴肝脏中自由基形成酶和自由基清除酶的活性受 Ge-132 调节。
(一)(二)
图 3。Ge-132 对促进猴肝制剂中超氧化物清除酶活性的影响。(a) 超氧化物歧化酶；(b) 过氧化氢酶。数据表示平均值±sem（n = 3 次测量）。RSD 值根据[标准偏差/算术平均值] 的等式计算，它们的超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 值分别为 3.2% 和 2.1%。
即，Ge-132 抑制形成 NAD(P)H-OD 和 XOD 的活性，并促进清除SOD 和 H 2 O 2降解 CAT 的活性，如图2和图 3所示。这些现象通常会导致活性氧（如H 2 O 2等）水平的降低。在生物有机体的细胞中。
关于 NAD(P)H-OD（图 2 (a)）和 XOD（图 2 (b)）的测定结果，肝脏中超氧阴离子 (O 2 - )的形成被认为是有限的与细胞中的胞质溶胶部分相比，细胞膜部分。NAD(P)H-OD 是膜特异性酶，即。膜内在和外在酶，XOD 是一种胞质溶胶特异性酶。
据报道，百合中的 NAD(P)H-OD 活性受到 cAMP [ 27 ] 的抑制，而其他应激酶，如 XOD、SOD、CAT 和 APOD 则不受影响。基于这一证据，Ge-132 通常可能在生物体细胞中诱导（形成）cAMP 方面发挥重要作用。分析cAMP 的诱导和Ge-132 之间的关系是必要的。
在这项研究中，如上所述的应激酶测定是使用肝匀浆离心（15,000 g）后的上清液部分进行的。因此，肝细胞内SOD的活性与肝脏静脉血、静脉血和动脉血中红细胞中SOD的作用可能有很小的关系。
应激酶的活性可能受 Ge-132 的调节，不分植物（百合花蕊）或动物（猴肝）。
5。结论
Ge-132 可能在维持低水平的活性氧以缓解各种压力方面发挥重要作用。换句话说，Ge-132 在活体中的处理可能会通过调节应激酶的活性来减少活性氧。这或许可以解释促进人和动物疾病康复的原因 [ 8 ]。图 4显示了 Ge-132 与猴肝脏中应激酶活性之间关系的推定模型的示意图。
图 4。Ge-132 与应激酶活性之间关系的推定模型的示意图，例如 NAD(P)H-氧化酶 [NAD(H)-OD]、黄嘌呤氧化酶 [XOD]、超氧化物歧化酶 [SOD]，过氧化氢酶 [CAT] 和过氧化物酶 [POD]，在猴子肝脏中。*POD根据H 2 O 2 + **AH 2 → 2H 2 O + **A等反应式将H 2 O 2 转化为H 2 O。黑色箭头：受 Ge-132 抑制，白色箭头：受 Ge-132 促进，虚线箭头：不受 Ge-132 作用。
我们假设 Ge-132 在猴肝脏中应激酶的应激信号传导中起着重要作用。因此，Ge-132 可能对预防癌症、肺病、风湿病等疾病以及改善我们的健康有很大帮助。
如今，Ge-132在医学和兽医领域被广泛应用于改善各种症状，如许多报道[ 6 ][ 10 ][ 12 ]-[ 18 ][ 20 ][ 21 ]。此外，根据许多癌症患者和其他每天服用 Ge-132 胶囊的人的个人交流，Ge-132 的积极作用已广为人知。
未来，Ge-132 的应用可能会根据图 4中指定的帐户在医学和兽医领域得到更多应用。此外，Ge-132的应用除医学和兽医领域外，还可能广泛应用于植物和微生物领域。实际上，在我们的初步实验中，Ge-132 在植物和细菌中显示出有效的生理作用。因此，Ge-132作为生理上合适的调节剂在各个领域都有广阔的前景。
致谢
肝脏样本由京都大学灵长类动物研究所提供。作者想借此机会感谢研究所。
披露声明
作者报告没有利益冲突。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
参考
[ 1 ] Doke, N. (1983) 超氧阴离子的产生与马铃薯块茎组织对不相容的致病疫霉种群感染和菌丝壁成分的超敏反应有关。生理植物病理学，23， 345-357。
[ 2 ] ádám, A., Farkas, T., Somlyai, G., 等人。(1989) 烟草中细菌引起的过敏反应产生的后果：膜脂的恶化。分子植物病理学，34, 13-26。
[ 3 ] Scandalios, JG (1993) 氧应激和超氧化物歧化酶。植物生理学，101，7-12。
[ 4 ] Fridovich, I. (1974) 超氧化物歧化酶。酶学和分子生物学相关领域的进展，41， 35-97。
[ 5 ] Fridovich, I. (1975) 超氧化物歧化酶。生物化学年度回顾，44, 147-159。
[ 6 ] Pronai, L. 和 Arimori, S. (1992) 免疫紊乱中血浆超氧化物清除活性降低——羧乙基锗倍半氧化物 (Ge-132) 作为泼尼松龙的促进剂。生物疗法，4，1-8。
[ 7 ] Oikawa, H. 和 Kakimoto, N. (1967) β-三氯锗乙基衍生物。日本化学会第 21 届年会摘要（日文版）。p. 2964. 日本化学会，东京，日本
[ 8 ] Asai, K. (1980) Miracle Cure——有机锗。日本出版公司，东京。
[ 9 ] Tsutsui, M.、Kakimoto, N.、Axtell, DD 等。(1976) “羧乙基锗倍半氧化物”的晶体结构。美国化学学会杂志，98，8287-8289。
[ 10 ] Sanai, T.、Okuda, S.、Onoyama, K.、Oochi, N.、Takaichi, S.、Mizuhira, V. 和 Fujishima, M. (1991) 与羧乙基锗倍半氧化物相比，二氧化锗诱导的慢性肾小管间质变化。肾脏国际，40，882-890。
微信公众号：essay留学英语德日论文翻译
微信公众号：essay留学英语德日论文翻译